PBMC分离流程及注意事项

纳米抗体生产中常常利用羊驼免疫后分离PBMC，接着完成纳米抗体文库构建。PBMC细胞分离最常见的方法是梯度离心法，也有其他纯化方法，比如可以通过粘附或暴露纯化。纳米抗体生产中，利用了单核细胞与其他细胞之间的密度差异。

PBMC细胞分离流程:

1.采集样本：获得书面同意后，从免疫动物体内，比如羊驼免疫完的静脉外周血中采集到足够量的样本，置于肝素钠管中。

2.稀释血液：将采集到的血与无菌PBS轻轻晃均匀，便于后续操作。

3.缓慢分层：将步骤2的样本沿着管壁缓慢地倒入分离液上，形成界面。

4.离心分离。

5.收集PBMC：离心完成，PBMC沉积在分离液与上层血浆之间。实验人员利用无菌吸管，将需要的取来，放于新的管中。

6.洗涤细胞：用适量的PBS或培养液对收集到的洗涤。

7.细胞计数和存储：对PBMC计数，确定细胞的数量。根据实验需求，可将PBMC重悬于适当的培养基中，并添加适量的冷冻保护剂，冻存备用或者进行后续纳米抗体文库构建。

细胞分离示意图

注意事项:

羊驼免疫中外周血容易发生凝结，卡梅德生物加入肝素后轻轻晃匀混合血液，防止发生凝结。如果有，则弃去含有凝块的样本。为了保持分离液和血液之间界面清晰，一直将离心管保持在45°角。

在抗体发现中关于PBMC分离过程中不同洗涤介质类型或离心速度和制动器使用对下游T细胞活化和功能的影响的研究有限。使用PBS或RPMI作为洗涤培养基，离心速度快，或RPMI作为低速和制动器的洗涤介质，有研究表明，使用不同的PBMC分离方法处理来自COVID-19疫苗接种参与者的血样。通过活化诱导标志物测定和干扰素γ测定对刺突特异性T细胞进行定量和表征，并比较处理方法之间的反应，完成抗体发现。用RPMI洗涤的样品显示出比用PBS洗涤的样品更高的AIM+CD4T细胞反应，并且显示出从幼稚向效应记忆表型的转变。激活标志物OX40在RPMI洗涤的CD4细胞上显示出更高的SARS-CoV-2刺突诱导上调，而CD137上调的差异在加工方法之间很小。AIM+CD8T细胞反应的幅度在处理方法之间相似，但显示出更高的刺激指数。在PBS洗涤的样品中，CD8 T细胞的背景频率增加，并且在FluoroSpot测定中与产生IFNγ的细胞的基线数量较高相关。RPMI+方法中较慢的制动并没有改善对SARS-CoV-2特异性T细胞的检测，并导致处理时间延长。

卡梅德生物有多年抗体发现项目经验以及PBMC细胞分离的项目经验，可以为纳米抗体生产，纳米抗体文库构建提供优秀的基础服务，同时，卡梅德生物还提供抗原制备、抗体定制、抗体纯化等全链条服务。

参考文献：

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