荧光原位杂交服务常见的问题及解决方案

1.如何减少FISH实验中背景的产生？

答：

（1）使用合适的探针量。（2）改善杂交后洗环节：a、准备新鲜配制的洗涤液；b、检查洗涤液的pH、c、检查水浴缸的温度（71-73度，一次不超过6片洗涤，每次洗涤后重新升温）；d、洗涤时震荡洗涤缸；e、延长洗涤时间（最长5分钟）。（3）使用DNA阻断剂，如Cot-1 DNA等。

2.地高辛标记探针的长度和浓度分别为多少合适？

答：

探针的标记长度应小于2.5 kb，最佳标记长度在 0.15 kb-0.95 kb 之间，片段过长易导致非特异杂交；片段短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短，但片段过短往往会降低检测灵敏度。

3.原位杂交实验中为什么会出现非特异性染色？

答：

非特异性染色的原因可能是来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等。探针特异性不高或是组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。此外，背景颜色深的原因还可能是探针浓度过高，信号产生过剩；切片在孵育中干涸；切片未冲洗或冲洗时间过短。而着色浅则可能为试剂未预温或室温低，可延长孵育时间；探针或靶核酸变性不足，可延长变性时间；杂交不完全，可延长杂交时间。

4.在原位杂交中，用PCR法进行地高辛标记探针时，应该加入多少模板量？

答：

用PCR法进行地高辛标记，模板浓度是产生特异性探针的最关键因素。根据市面上两款主流产品Roche和BIOG地高辛标记试剂盒的说明书推荐，模板的加入量为基因组DNA在1-50 ng之间，质粒DNA在10-100 pg之间为宜。

5.同一样本可以多次进行荧光原位杂交吗？

答：

一般情况下，如果操作没有得到理想的结果，是可以将探针洗涤然后进行再次的杂交的。如果使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。

6.在实际荧光原位杂交操作中，那些因素比较重要？

答：

实验中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA/RNA的杂交效率;光照影响着荧光染料的强度，所以探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬火剂封片目避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。

7.直标型探针和间标型探针有什么区别？

答：

直标型探针是指探针共价连接荧光表基团，间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针-半抗原-荧光素基团，类似“三明治”的复合物，与间标型探针相比，直标型探针具有低背景，高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在荧光原位杂交检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。