哺乳动物细胞转染常见问题及解决方案

1.转染效率低的原因是什么?

答：

（1）原因：细胞状态差或不恰当的细胞密度。解决方法：接种状态良好的细胞，按转染试剂要求的最适密度接种细胞。

（2）原因：DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清的条件下形成。解决方法：建议在复合体形成时不要使用血清。

（3）原因：转染体系中是否存在抑制剂。解决方法：不要在培养基中使用抗生素、EDTA、柠檬酸盐、磷酸盐等物质。

（4）原因：阳离子脂质体试剂冻结。解决方法：不要使用储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。

（5）原因：质粒纯化的问题。解决方法：建议使用转染级的质粒纯化试剂盒。

2.转染时的细胞密度和传代次数会影响转染效果吗?

答：细胞密度会影响转染效率，汇合度为50-70%时，具有优秀的转染性能，而在低于或高于该密度的情况下，都会对转染效率造成影响。传代次数可能影响转染实验。传代次数过多或传代不恰当都可能会降低转染效率，在细胞分瓶和铺板时操作要保持一致。如果转染效率开始降低，且所用细胞已培养很长时间、传代过多、或有过不适当的传代操作，建议复苏于液氮中保存的细胞重新开始培养。

3.转染重复性不好是什么原因导致的？

答：可能是由于转染时的融合度波动和细胞发生变化导致，不同批次的转染时最好保持所有的转染参数恒定，如融合度、传代次数和生长时间相等。尽量使用新融化的细胞进行实验。

4.转染后出现细胞死亡是什么原因？应该如何处理？

答：脂质体毒性、转染浓度过高、转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡，这种情况下就需要适当优化转染条件，适当调整细胞传代数、细胞密度、转染浓度和转染时间等。另外，如果靶基因对于维持细胞生长是非常重要的，出现细胞死亡的现象可能正是由于基因表达受干扰引起的，如果由于细胞死亡而影响检测的话，可以适当调整检测时间。

5.转染后什么时候做qPCR检测？什么时候做WB检测？

答：一般来说，转染后48小时进行qPCR检测，转染后48-72小时进行蛋白检测。

6.为什么会观察到靶基因的表达水平在瞬时转染的细胞中要高于稳定转染的细胞？

答：瞬时转染的细胞具有更高的基因拷贝数，因而可实现更高的表达水平。稳定转染细胞的表达水平取决于整合拷贝数，每个细胞的整合拷贝数通常大约为1-2。因此通常瞬时转染时的目的基因表达量都要高于抗生素筛选后的稳定转染细胞株。

7.如何优化转染条件？

答：实验条件的优化，主要从影响因素入手，包括转染前细胞密度调整，转染浓度，检测时间等。这里需要强调的是实验对照的设定，也是一个很重要的优化实验的手段，每个实验必须有相应的对照。