浅谈蛋白质N端测序

目前，了解蛋白质结构和功能的重要手段是氨基酸测序，N端是蛋白质合成的开始，也是蛋白质和多肽重要的结构和功能部位,由于蛋白质N端序列的特异性很高，因此只需要几个氨基酸残基就可以通过蛋白质测序对大多数蛋白质进行鉴定，N端测序主要用来确定蛋白质氨基酸序列的开始部分。蛋白质N端序列的组成会影响蛋白质的生物学功能，例如，N端序列与蛋白质的半衰期、蛋白亚细胞器定位有关，并且N端可发生许多种翻译后修饰，通过蛋白质测序去分析蛋白质N端序列能够揭示蛋白质的生物学功能。

蛋白质N端测序被广泛应用于生物医学研究、疾病诊断、蛋白断裂研究和药物开发方面。通过N端测序，可以确定蛋白质合成的起始位置，有利于蛋白质合成机制的研究；蛋白质的N端序列在翻译后修饰过程中可能发生变化，利用N端测序可以检测这些变化，进而辨别蛋白质是否被修饰；N端测序还可以检测出特定蛋白质的存在以及蛋白纯度，有利于进行蛋白纯化；通过研究蛋白质N端序列，可以发现新的药物靶点，为药物开发提供新的依据；此外，蛋白质N端测序的数据可以用于预测蛋白质结构，有利于进行蛋白断裂研究等相应的科学研究。

蛋白质N端测序的原理：

蛋白质N端测序包括非质谱技术与质谱技术，N端测序的原理主要基于非质谱技术的Edman化学降解法，也称为Edman测序。首先是偶联反应的发生，蛋白质的N端与异硫氰酸苯酯（PITC）等化学试剂产生反应，形成一个稳定的苯氨基硫甲酰酞（PTC）衍生物，即PTC-肽，使得N端的氨基酸残基与特定的化学基团结合。在碱性条件下，PTC-肽会发生环化裂解，生成一个噻唑呤酮苯胺（ATZ）中间体，N端的氨基酸残基会从肽链上分离出来，并且其原有的连接顺序不会改变。ATZ中间体随后被转化为一种稳定的、易于检测的化合物，也就是苯异硫尿氨基酸（PTH-氨基酸），之后通过色谱分析或质谱分析可以鉴定出PTH-氨基酸的种类，进而通过氨基酸测序了解蛋白质N端的氨基酸序列。上述的过程在每次循环中都能够从蛋白质的N端去除一个氨基酸残基，并且下一个新的游离N端会被暴露出来，通过连续多次的循环氨基酸测序，可以逐步确定蛋白质N端的完整氨基酸序列。虽然Edman测序的准确性很高，但用于Edman测序的蛋白质或多肽必须是高纯度的，并且Edman测序只适于一定残基的特定修饰, 没有普遍适用性。随着质谱技术的不断进步，基于质谱的各种化学修饰技术不断地发展和完善，加深了我们对蛋白质的结构和功能的了解，与此同时，高灵敏度、高分辨率和高通量的质谱技术也为蛋白质N端测序提供了一种重要的选择。

蛋白质N端测序的样本要求：

用于进行蛋白质测序的样本决定着后续实验结果的好坏，样本纯度一般要大于90%，有些设备可能需要纯度高于95%。样本的具体含量会因为设备的不同而有所差别，通常在50-100pmol。由于封闭或修饰的N端会阻碍Edman降解法的进行，因此用于测序的蛋白质N端必须未被封闭或修饰。样本中应尽量避免含有可能干扰测序过程的物质，如蛋白酶、氨基酸、盐分、乙醛等。样本类型可以是PVDF膜上的蛋白质斑点、蛋白冻干粉或天然纯化多肽样品，不同的样本形式可能会用到不同的处理方法。

在处理样本时，首先要根据样本的来源去选择适当的提取与纯化方法，纯化后的蛋白质需要被溶解在适当的溶剂中，如蒸馏水、TFA水溶液等，并将溶液调整至合适的浓度范围。对于PVDF膜上的样本要确保蛋白质均匀分布在膜上，并且在转膜过程中不能使用会干扰测序的含有甘氨酸的缓冲液。在处理样本的过程中，必须进行无菌操作，避免样本被污染。处理好的样本要注意保存方式，避免高温或强光刺激。样本运输过程中要使用干冰进行冷冻保护，避免其发生降解。在溶解和稀释样本时，要避免使用含有1级、2级胺的盐溶液以及含有SDS的溶液，否则可能会干扰测序结果。

Fig. 1 N端测序结果图

Fig. 2 N端测序MS/MS结果图

卡梅德生物多年来致力于重组蛋白表达与制备研究，在进行重组蛋白表达纯化产物的分析过程中，需要对蛋白的N端序列进行确认。N端区域是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位，通过N端的少数几个氨基酸残基就可以对大多数蛋白质进行鉴定。我们拥有经验丰富的技术人员，优质的测序仪器，应用现有的质谱技术平台，可以提供高质量的蛋白质N端测序服务，通过Edman降解法能够准确的测定蛋白质N端多达67个氨基酸序列。卡梅德生物可以进行抗体药物N端序列验证，能够对天然提取以及分离纯化的小分子多肽序列进行鉴定，并且实验周期短，仅需2-3周。

参考文献：

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