浅谈蛋白质互作及pull down实验

Pull-down实验（又叫蛋白拉下实验），是在体外确定蛋白质之间是否互作的方法。蛋白拉下实验与Co-IP实验类似，均属于检测蛋白互作实验，这两种方法的区别在于，Co-IP实验是获得已知蛋白的互作蛋白，具有一定的真实性，但是无法确认互作的蛋白之间是直接还是间接互作；Pull-down实验是找出与已知蛋白互作的未知蛋白，可直接确认已知蛋白和检测蛋白是是否互作，但无法得知在体内的结合情况。

1、GST Pull-down实验原理

该方法是将已知的蛋白质固定在磁珠上，互作的蛋白质被附，通过改变洗脱液或洗脱条件蛋白复合物被洗脱。收集的液体包含互作的蛋白，通过SDS-PAGE进行分离，然后通过凝胶染色或WB实验检测。

1988年Smith等纯化出GST融合蛋白，目前该融合蛋白已应用于Pull-down实验中，被称为gst pull down。gst Pull-down是在目的蛋白上加入GST标签，通过GSH捕获互作蛋白，将结合物洗脱后通过WB实验验证。

His Pull-down是使用金属离子如镍或钴作为介质，通过亲和层析纯化蛋白，将结合物洗脱后通过WB实验验证。

此外，还有DNA Pull down、RNA Pull down、小分子pull down实验等。

DNA Pull down是确定DNA与蛋白结合的体外方法。通过WB实验检测特定蛋白是否与靶DNA结合；通过MS鉴定未知的与DNA片段结合的蛋白。

RNA Pull down是确定RNA与蛋白结合的体外方法。通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用；通过MS鉴定未知的与RNA结合的蛋白。

SM pull-down（小分子pull down实验）能够发现与小分子特异性结合的靶点蛋白，与MS结合可以精确的进行小分子靶点蛋白筛选，分为体外标记法和生物正交法。

图1 gst pull down实验原理图

2、样本

样本来自动植物组织、细胞等，蛋白的含量受样本量的影响。

（1）原核蛋白样品：利用含有His标签表达的质粒通过纯化获得His融合蛋白，利用含有GST标签表达的质粒通过纯化获得GST融合表达蛋白。

（2）真核蛋白样品：裂解细胞，获得含有目标蛋白的细胞裂解液。

（3）动物组织样品：制备样品时去除脂肪等物质，避免影响实验结果。

（4）植物组织样品：植物叶片组织叶绿素等物质丰度较高，对实验结果造成一定的影响。

3、技术案例结果图

（1）银染结果图

Pull-down检测可通过银染检测蛋白质质量，通过银染结果切胶送质谱服务，以此减少杂蛋白的干扰。与WB相比，银染方法灵敏度较高，更适用于检测蛋白质含量较低的样本或目标蛋白质含量较少的样本。

银染实验的评判标准：以案例为准，显示目的探针组有差异蛋白拉出，所以可以进行后续的质谱分析。

（2）WB结果图

WB是验证两个已知蛋白是否相互作用的验证手段之一。

（3）MS结果图

质谱检测是将产物蛋白进行酶解，消化成多肽，再测定多肽，从而获取序列，与蛋白数据库进行比对，得到潜在结合蛋白的结果。

基于以上内容，卡梅德生物公司能够提供各类样本的处理服务及相应的Pull-down实验服务，与其他生物公司相比，卡梅德生物公司的Pull-down技术来源于日本京都大学IPS实验室，可以提供高质量的实验数据和支持，推动你的研究或项目顺利进行。

此外，卡梅德生物公司还提供蛋白互作实验服务，包括酵母双杂交、Co-IP、免疫沉淀实验等，可满足不同客户的实验需求。

参考文献：

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[2] Lyu S, Zhang C, Hou X, Wang A. Tag-Based Pull-Down Assay [J]. Methods Mol Biol. 2022, 2400: 105-114.

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