蛋白质N端测序实验

1.蛋白质N端测序实验简介

重组蛋白表达纯化产物的分析过程，需要对蛋白的N端序列进行确认。N端区域是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位，通过N端的少数几个氨基酸残基就可以对大多数蛋白质进行鉴定。

蛋白质N端测序的两种主要方法是Edman降解（Edman degradation）和质谱法（Mass spectrometry）。质谱法将蛋白消化成5-25个氨基酸的肽，随即通过LC-MS/MS分析检测，将采集的数据与理论序列数据库进行匹配，进而确认N端序列。质谱可以测出封闭和修饰的蛋白质N末端，且已成为首选的全长抗体测序方法。

Edman降解法与质谱法不同，Edman降解法属于化学方法，随之延伸出的Edman测序已成为一种成熟的蛋白质序列测定技术，其不需要借助蛋白数据库便可以直接进行序列分析。Edman测序的一个关键优势是结果直观，可以直接得到氨基酸序列，但它不能用于N-末端封闭或修饰后的氨基酸残基。Edman测序质量随着检测氨基酸的数量上升而下降，所以通常只用于确定前30-60个氨基酸，其检测长度最多不超过100个氨基酸。因此，Edman测序不能用于进行蛋白全长测序。

质谱法和Edman降解法两者各有所长，相互补充。因此，可将质谱法LC-MS/MS的N-端测序技术与基于Edman降解的测序技术相结合形成互补，便可准确鉴定蛋白质的N-端序列。     

2.蛋白质N端测序实验的原理

Edman法测定单个氨基酸循环包括3步：第一步是在碱性条件下，PITC与蛋白N端的游离氨基结合；第二步是在酸性溶液中，N端残基被切除；第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基，经过在线的HPLC分析，根据洗脱时间来确定氨基酸种类。

图1：蛋白质N端测序原理

3.蛋白质N端测序实验流程

（1）蛋白样品一般先进行SDS-PAGE的分离，保证样品的纯度满足测序的要求；

（2）随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上；经过染色确定把蛋白条带并切出；

（3）Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。

4.蛋白N端测序样品要求

100-200ug蛋白，纯度>95%，PVDF转膜样品，考马斯亮蓝R250染色；每条泳道的样品尽量用最高浓度样品，上最大体积（尽量使条带长胖为正常的 2-3 倍宽度）；在电转印中使用的缓冲液尽可能不含甘氨酸；修饰封闭：N 端未被封闭；无干扰物：蛋白酶、氨基酸、胺、盐分、乙醛、去污剂等。