单B细胞可以通过随机分离和抗原特异性分离两种方式，从外周血或淋巴组织中提取。随机B细胞分离可采用显微操作、激光捕获显微切割或荧光激活细胞分选（FACS）等技术进行筛选。抗原特异性分离则可以使用抗原包被的磁珠、荧光标记抗原的多参数FACS、溶血斑块实验或荧光焦点法来筛选特异性B细胞。利用FACS技术，研究人员能够根据特定细胞表面标志物的表达模式，清晰区分待分选B细胞的发育和分化阶段，几乎可以从任何阶段的B细胞中进行分选。为确保获得特异性抗体，需在单细胞分离前评估供体的免疫应答，例如通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）测定外周血中抗体特异性细胞（ASC）的丰度，从而选择含有较高抗原特异性抗体浓度的血样进行后续制备。

单细胞的cDNA合成通常在96孔板上进行。全长免疫球蛋白（Ig）基因的转录产物通过巢式或半巢式RT-PCR扩增。对于抗体重链和轻链的可变区，设计前向引物的混合物，而反向引物则特异性互补于抗体的恒定区。在某些情况下，如果需要分离和扩增不同同种型的抗体，反向引物将是特异性互补于各类同种型抗体恒定区的混合物。扩增后的基因可直接转染至哺乳动物细胞中，以实现单克隆抗体的体外表达。

在鉴定抗体或抗体片段的抗原特异性和生物活性之前，需要将携带抗体基因的表达载体在适当的系统中进行表达。最常见的表达系统是原核系统（如大肠杆菌），而哺乳动物细胞系统（如HEK 293或CHO细胞）则更适合进行抗体的翻译后修饰，主要采用瞬时表达或稳定表达。在大肠杆菌中，通常抗体基因以抗原结合片段（Fab）的形式表达，而在哺乳动物细胞中，则以完整的IgG形式进行表达。通过这一系列步骤，研究人员能够高效获得特异性抗体，为后续的应用提供支持。